Analyse d’une cyclooxygénase putative de Trypanosoma brucei et son éligibilité comme possible cible thérapeutique

Promoteur: Prof. Dr. Michael Duszenko

                 Institut Interfacultaire de Biochimie (IFIB), Université de Tübingen (UNITUE)

Co-Promoteur : Prof. Dr. Benjamin Mordmüller

                      Institut de Médecine Tropicale, Université de Tübingen (UNITUE)

Membres du Jury : Prof. Dr. Thilo Stehle (IFIB) – UNITUE, Prof. Dr. Dirk Schwarzer (IFIB) – UNITUE,               Prof. Dr. Benjamin Mordmüller and Prof. Dr. Michael Duszenko.

Date de la soutenance: 28.07.2017

Lieu : IFIB – UNITUE, Allemagne

Résumé de la thèse de doctorat du Dr. Célestin Nzanzu Mudogo

La trypanosomiase humaine africaine (THA) ou maladie du sommeil est l’une des maladies tropicales négligées et mortelles, affectant les personnes vivant en Afrique sub-saharienne. Elle est causée par un parasite protozoaire unicellulaire : Trypanosoma brucei (T. brucei gambiense et rhodesiense) transmis à l’hôte humain par piqure des mouches tsé-tsé. La thérapie THA repose toujours sur des médicaments dont l’utilisation est limitée par la toxicité et les régimes de traitement rigoureux, alors que le développement des vaccins reste très improbable en raison de l’efficacité de la variation antigénique. Il y a un besoin éminent d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et de développer de meilleurs médicaments contre le THA. Le séquençage du génome de T. brucei a révélé environ 50% des gènes qui sont jusqu’à présent non caractérisés par rapport à leurs fonctions biochimiques ou cellulaires, mais sont identifiés comme des « protéines hypothétiques » sans homologues chez l’hôte humain. Cela ouvre des possibilités pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et la découverte de médicaments. Dans cette thèse, une protéine annotée hypothétique au sein du génome du T. brucei, identifiée comme une enzyme putative de cyclooxygénase (pTbCOX), a été analysée pour la validation génétique et la détermination de sa structure tridimensionnelle.

Les analyses bio-informatiques de pTbCOX n’ont révélé aucune protéine homologue chez l’homme ou dans tout autre organisme, sauf dans la famille des kinetoplastides. En outre, aucune indication n’a été trouvée concernant les domaines spécifiques, les séquences des signaux ou les ancres membranaires.

Par conséquent, le pTbCOX est un excellent exemple d’une protéine annotée comme « protéine hypothétique » dans le génome du T. brucei, remplissant un des critères de sélection des cibles thérapeutiques. De ce fait, il constitue une cible thérapeutique attrayante pour une validation scientifique.

Dans cette étude, nous présentons le clonage, l’expression, le repliement et la purification de pTbCOX dans E. coli BL21 (DE3). Le pTbCOX a été trouvé presque exclusivement à l’intérieur des corps d’inclusion, sous une forme insoluble. Le pTbCOX replié a été purifié à l’aide d’une colonne Ni-NTA sous le contrôle du système ÄKTA-FPLC. Le pTbCOX a été obtenu en faible quantité à cause de sa forte tendance à former des agrégats, comme cela a été révélé par la chromatographie d’exclusion de taille, par Diffusion Dynamique de la Lumière (DLS) et par Dichroisme Circulaire (CD) spectroscopies. Enfin, le pTbCOX a été exprimé dans l’insecte Sf9 et a produit in vivo des micro-cristaux en forme d’aiguilles, 14 jours après l’infection en utilisant le stock de virus P3. Ces cristaux ont été analysés par Western Blot, par une microscopie électronique à balayage (TEM et SEM) et par Imagerie Optique Non-linéaire de deuxième ordre des Cristaux Chiraux (SONICC). Ces expériences constituent une caractérisation préliminaire des cristaux de pTbCOX avant leur analyse par Laser à Electron Libre et à Rayons X (XFEL) ou par Micro-Electron Diffraction (MicroED) pour l’élucidation structurale.

Les spéctroscopie DLS et CD des cristaux de pTbCOX solubilisés à l’aide d’un tampon acétate ont révélé un état optimal par lequel pTbCOX est stable et mono-dispersé.

Les études de RNA interférence (RNAi) ont démontré que pTbCOX est essentiel pour la division cellulaire et la morphogenèse de la forme sanguine du parasite T. brucei. Les phénotypes produit du RNAi ont été analysés par fluorescence, SEM et TEM microscopies. De manière surprenante, la surexpression de pTbCOX-eGFP était mortelle pour le trypanosome de la forme sanguine et apparaissait comme un seul point près du kinetoplaste ou entre le kinetoplaste et le noyau.

Par conséquent, pTbCOX semble être un candidat cible thérapeutique approprié à prendre en compte pour la découverte de nouveaux médicaments (inhibiteurs ou activateurs) contre la THA. Cependant, le défi est toujours en cours pour obtenir pTbCOX natif, en élucider la structure et la fonction physiologique.